۴) واكنش آنتی ژن و آنتی بادی یك واكنش تعادلی غیركووالانی بوده، اندازه گیری در نقطه تعادل، دقیق و تكرارپذیر است. لذا در كلیه روش های سنجش ایمنی زمانی به نام زمان انكوباسیون مطرح است. در واقع این زمان برای به تعادل رسیدن واكنش در نظر گرفته شده است. در روش IRMA به دلیل اینكه اغلب رقابت وجود ندارد، برای حصول اطمینان از كفایت آنتی بادی ها برای تشكیل كمپلكس غلظت های بالای آنالیت، همواره مقدار زیادی از آنتی بادی ها به كار می رود،

در روش IRMA به دلیل معرف مازاد، طبق اصل لوشاتلیه تعادل به سمت تشكیل كمپلكس جابه جا می شود. لذا غلظت بالای مواد اولیه سرعت به تعادل رسیدن یا زمان انكوباسیون را كاهش می دهد. بنابراین یكی دیگر از مزایای روش IRMA نسبت به RIA كاهش زمان انكوباسیون است،

۵) محدوده قابل اندازه گیری آنالیت را محدوده عملكرد روش می گویند. این محدوده فاصله بین اولین و آخرین نقطه استاندارد است. در روش RIA مبنا رقابت است و همیشه در محدوده معینی از غلظت ها رقابت معنا دارد، ولی در IRMA به ازای هر آنالیت یك كمپلكس سیگنال دهنده تشكیل می شود، لذا محدوده عملكرد در IRMA حدود ۱۰۰ برابر بیشتر از RIA است،

۶) در روش RIA كلیه مراحل نمونه برداری از نمونه، استاندارد، كنترل و محلول نشاندار دارای اهمیت بوده، در دقت كل روش سهیم است. روش IRMA همان طور كه ذكر شده یك روش معرف مازاد است و مرحله افزودن آنتی بادی كونژوگه تأثیر كمتری نسبت به همین مرحله در RIA دارد. لذا در كل، دقت مرحله نمونه برداری در IRMA وابستگی كمتری نسبت به RIA دارد و این یكی دیگر از مزایای IRMA محسوب می شود و

۷) مقاومت روش در برابر شرایط آزمایش یكی دیگر از پارامترهای روش شناسی است. در IRMA بیشتر از RIA از آنتی بادی مونوكلونال استفاده می شود. در مورد آنتی بادی مونوكلونال می توان شرایط محیطی از لحاظ PH، قدرت یونی و ... را طوری تنظیم كرد كه شرایط ایده آل تأمین شود اما در آنتی بادی های پلی كلونال انتخاب شرایط خاص برای گروهی از آنتی بادی ها مطلوب و برای برخی دیگر غیرمطلوب است. لذا این شرایط برای گروهی از آنتی بادی ها به مرور زمان مضر بوده، در حقیقت مقاومت روش IRMA نسبت به RIA در برابر شرایط آزمایش بیشتر است.

در ادامه به برخی از محدودیت ها و معایب روش های سنجش ایمنی رادیواكتیو اشاره می شود:

۱) خطر تشعشع، و خطر تشعشع هر چند ناچیز،

۲) نیاز به امكانات حفاظتی در برابر پرتوها،

۳) تولید زباله های رادیواكتیو،

۴) محدود بودن زمان انقضاء كیت ها به دلیل نیمه عمر كوتاه

۵) محدودیت اتوماسیون

اساس روش سنجش های ایمنی آنزیمی

اساس این روش ها مانند سنجش های ایمنی رادیواكتیو همان واكنش آنتی ژن آنتی بادی است، با این تفاوت كه جهت ردیابی واكنش مذكور به جای رادیواكتیویته از آنزیم ها و واكنش های آنزیمی استفاده می شود.

در این روش نیز می توان جهت ردیابی واكنش، آنتی ژن و یا آنتی بادی را با آنزیم نشاندار ساخت. به عمل نشاندارسازی، كونژوگاسیون و به مولكول آنزیم دار، كونژوگه آنزیمی می گویند. چنانچه آنتی ژن كونژوگه گردد روش EIA (Enzyme Immuno Assay) گویند و اگر آنتی بادی كونژوگه گردد روش را IEMA (Immuno Enzymo Meteric Assay) نامیده می شود.

اساس روش EIA، رقابت میان آنتی ژن كونژوگه و آنتی ژن آزاد در نمونهٔ مورد سنجش بر سر اتصال به آنتی بادی است. در اینجا نیز میزان كمپلكس آنزیم دار با آنتی ژن آزاد رابطه معكوس دارد. لذا می توان بسته به نیاز از آنتی بادی های پلی كلونال یا مونوكلونال استفاده كرد.

البته در برخی سنجش ها آنتی بادی های الیگو كلونال پاسخ بهتری ایجاد می كند. (چنانچه چند نوع آنتی بادی مونوكلونال را با هم مخلوط كنیم، مجموعه حاصله را آنتی بادی الیگوكلونال می نامند).

یكی از تفاوت های RIA با EIA در این است كه اغلب، آنالیت رادیواكتیودار از لحاظ ساختمان شیمیایی و ابعاد فیزیكی با آنالیت سرد یكسان بوده یا تفاوت ناچیزی دارد اما در EIA آنالیت كونژوگه به آنزیم (كه اغلب مولكول های پروتئینی بزرگی است) متفاوت است، لذا نوع آنتی بادی به كار رفته و شرایط سنجش خصوصاً زمان انكوباسیون به گونه ای طراحی می شود كه این تفاوت ساختمان و ابعاد بر واكنش آنتی ژن آنتی بادی اثر سوء به جای نگذارد.

انواع روش های ایمنی آنزیمی عبارتند از:

۱) EIA رقابتی برای آنتی ژن:

در این روش آنتی ژن كونژگه و آنتی ژن آزاد بر سر اتصال به آنتی بادی مشترك با یكدیگر رقابت می كند. پس از جداسازی كمپلكس آنزیم دار از كونژوگه ازاد، فعالیت آنزیمی مبنای سنجش قرار می گیرد. در اینجا نیز رابطه معكوس میان كمپلكس آنزیمی و آنالیت آزاد وجود دارد. ابتدا واكنش آنزیمی مربوط به كمپلكس آنزیمی در حضور مقادیر معینی از آنالیت آزاد (استانداردها) بررسی شده، محور xها نشان دهنده غلظت آنالیت آزاد و محور yها مؤید فعالیت كمپلكس آنزیم دار بر حسب جذب نوری (OD) است. منحنی استاندارد، نزولی رسم شده و بر اساس آن میزان آنالیت در نمونه های مجهول سنجیده می شود،

۲) IEMA برای آنتی ژن:

ابتدا آنتی ژن با مقادیر مازاد آنتی بادی نشاندار واكنش می دهد. سپس مقادیر مازاد آنتی ژن تثبیت شده به محیط افزوده می شود تا با مابقی آنتی بادی وارد واكنش شود با جداسازی آنتی ژن های تثبیت شده و سنجش فعالیت آنزیمی متصل به آنتی ژن محلول، می توان میزان آنتی ژن را مشخص كرد. در اینجا نیز سیستم رقابتی نبوده، میزان فعالیت آنزیمی مشاهده شده با میزان آنالیت آزاد رابطه مستقیم دارد.

۳) IEMA ساندویچی برای آنتی ژن:

در این روش آنتی ژن یا آنالیت مذكور باید حداقل دو شاخص آنتی ژنیك مجزا و دور از هم داشته باشد. آنتی ژن طی یك یا در مواردی طی دو مرحله توسط آنتی بادی اول و آنتی بادی كونژوگه دوم ساندویچ می شود. پس از جداسازی آنتی بادی كونژگه مازاد كه در واكنش شركت نكرده، فعالیت كمپلكس ساندویچی آنزیم را اندازه گیری می كند. در این واكنش نیز به ازای هر آنالیت یك ساندویچ آنزیم دار تشكیل شده، رابطه مستقیم بین میزان آنالیت و فعالیت كمپلكس آنزیم دار وجود دارد،

۴) IEMA ساندویچی برای آنتی بادی:

در این روش آنتی بادی مورد سنجش بین آنتی ژن تثبیت شده و آنتی بادی دوم علیه آنتی بادی مورد سنجش ساندویچ می شود، آنتی بادی دوم با آنزیم نشاندار شده است. پس از انكوباسیون و شست وشو فعالیت ساندویچ آنزیم دار را با افزودن سوبسترهای مناسب آنزیم دار اندازه گیری می كنند و میزان فعالیت آنزیم با غلظت آنتی بادی مورد سنجش رابطه مستقیم دارد،

۵) الایزای هوموژن:

همان طور كه اشاره شد نیاز به اندازه گیری روزمره و تعداد بالای برخی درخواست ها، بحث اتوماسیون را مطرح نمود. یكی از شرایط كمك كننده برای اتوماسیون هوموژن بودن سیستم است، یعنی سیستم سنجش نیازی به مراحل جداسازی مانند سانتریفیوژ كردن ندارد و فعالیت آنزیم برخلاف رادیواتیویته می تواند در حالت آزاد و متصل متفاوت باشد، مثلاً اتصال آنتی ژن به آنتی بادی سبب فعالیت یا مهار فعالیت آنزیم متصل به كمپلكس گردد، لذا نیازی به مرحله جداسازی نیست .

۶) سایر روش های الایزا:

در سیستم های الایزا می توان آنتی بادی و آنزیم دار و آنتی بادی آزاد را در اتصاف به آنتی ژن به رقابت گذاشت یا آنتی بادی و آنتی ژن آنزیم دار را وارد واكنش نمود و سپس آنتی بادی تثبیت شده را جهت جمع آوری آنتی ژن آنزیم دار مازاد به محیط افزود و پس از جداسازی، فعالیت آنزیمی را در محلول یا در فاز تثبیت شده مورد سنجش قرار داد.

در حالت اول رابطه مستقیم و در حالت دوم رابطه معكوس است.

در سنجش های آنزیمی به طور عمده از آنزیم پراكسید از (HRP) و فسفاتاز قلیایی (ALP) استفاده می شود اما می توان از هر نوع آنزیمی كه فعالیت ویژه آن بالا باشد، به فرم خالص و ارزن قابل تهیه باشد، جایگاه های مناسب جهت كنژوگاسیون پایدار به آنتی ژن یا آنتی بادی را داشته باشد و اندازه گیری میزان فعالیت آنها در آزمایشگاه های معمولی میسر باشد، بهره گرفت. البته هیچ كدام از اجزاء واكنش آنزیمی ترجیحاً نباید سمی و خطرناك باشد.

كلیه مزایایی كه IRMA بر RIA دارد در مورد IEMA بر EIA نیز حاكم است، لذا از تكرار جزئیات آن خودداری می شود.

مزایای IEMA نسبت به EIA:

سادگی نشاندار كردن، افزایش حساسیت، ویژگی بالاتر، سرعت بیشتر واكنش، محدوده وسیع تر از غلظت آنالیت و مقاومت بیشتر در برابر شرایط آزمایش.

مزایای روش های سنجش ایمنی آنزیمی به روش های سنجش ایمنی رادیواكتیو

ـ عدم وجود خطر تشعشع

ـ قیمت ارزان تر دستگاه ها

ـ معرف های ارزان

ـ نیمه عمر طولانی كیت های آنزیمی،

ـ امكان اتوماسیون،

ـ سرعت خوانش بالا:

ـ امكان افزایش حساسیت روش.

سنجش های نشاندار آنزیمی علاوه بر امكان ردیابی، امكان تقویت نیز دارد یعنی واكنش آنزیمی ، هر آنالیت را به یك كمپلكس آنزیم دار و هر آنزیم را به میلیون ها تغییر در ماده اولیه یا محصول مرتبط می سازد.

از آنجایی كه آنزیم های متفاوت، واكنش آنزیمی متفاوت و قابل ردیابی ایجاد می كند در یك نمونه می توان با استفاده از دیا چند كونژوگه آنزیمی و پیگیری چند فعالیت آنزیمی، چند آنالیت را به طور همزمان مورد سنجش قرار داد. هر چند فراهم آوردن شرایط یكسان برای فعالیت مناسب چند نوع آنزیم كار پیچیده ای است اما امكان پذیر است و امكان سنجش همزمان سرعت آزمون ها و همچنین هزینه آنها را كاهش می دهد.

محدودیت سنجش ایمنی آنزیمی

سنجش ایمنی آنزیمی دارای برخی محدودیت ها نیز هست:

۱) همان طور كه اشاره شد، فعالیت رادیواكتیو یك پارامتر ثابت فیزیكی است كه میزان آن تحت تأیید شرایط محیطی مانند نور، درجه حرارت، آلودگی و ... قرار نمی گیرد اما واكنش آنزیمی تحت تأثیر پارامترهای مختلف قرار می گیرد لذا ردیابی رادیواكتیو پایدارتر و آسان تر از اندازه گیری فعالیت آنزیمی است،

۲) اجزاء مختلف موجود در نمونه می توانند واكنش آنزیمی را تحت تأثیر قرار دهد و

۳) سیستم های هوموژن آنزیمی در حال حاضر فاقد حساسیت كافی بوده، در ضمن كاربرد آنها عمدتاً به هاپتن ها محدود شده است.

وجود محدودیت های فوق نظر محققان را به استفاده از سایر نشانگرها معطوف نموده است.

دكتر مجتبی صلوتی، گروه میكروبیولوژی، دانشگاه آزاد زنجان

مهندس فرانك سقطچی، گروه رادیولوژی، دانشگاه علوم پزشكی زنجان

دكتر احمد بیطرفان رجبی، بخش پزشكی هسته‌ای بیمارستان قلب شهید رجایی

منابع:

۱- اصول علمی الایزا، دكتر محمودجواد رسایی

۲- آشنایی با مبانی تئوری الایزا، دكتر مهدی هدایتی

۳- ایمونولوژی رویت، ایوان رویت، مترجم: دكتر عطیه عبادی، سارا مظاهری

۴- هیتوشیمی در پاتولوژی، دكتر فرخ قوام


شما در حال مطالعه صفحه 2 از یک مقاله 2 صفحه ای هستید. لطفا صفحات دیگر این مقاله را نیز مطالعه فرمایید.